Wróć

Metoda oznaczania selenu i arsenu w materiałach biologicznych techniką atomowej spektrometrii fluorescencyjnej z generacją wodorków

Renata WIETECHA-POSŁUSZNY


Prowadzone przez wiele lat, obserwacje i badania niejednokrotnie udowodniły znaczący wpływ pierwiastków na organizmy żywe. W zależności od roli, jaką pełnią wyróżniono trzy podstawowe grupy (wg. The Food and Nutritional Board of The National Academy of Sciences USA): makro- i mikroelementy oraz pierwiastki silnie toksyczne.

Zarówno pozytywny jak i szkodliwy wpływ składników mineralnych zależy przede wszystkim od stężenia danego pierwiastka oraz czasu jego działania (Paracelsus - "Wszystko jest trucizną i nic nią nie jest. Dawka decyduje tylko, czy coś nie jest trucizną").

Fizjologiczna i terapeutyczna funkcja makro- i mikroelementów polega głównie na aktywowaniu procesów biochemicznych i wspomaganiu działalności enzymów. Niektóre spośród składników mineralnych pod postacią koenzymów lub jonów metali odgrywają bardzo istotną funkcję w układzie immunologicznym, chroniąc nasz organizm przed działaniem bakterii, wirusów, wolnych rodników. Dodatkowo łatwość, z jaką składniki mineralne tworzą związki chelatowe jest wykorzystywana w procesach międzykomórkowych do przenoszenia i przyswajania istotnych substancji biologicznych przez komórki, tkanki i narządy oraz do zobojętniania niektórych silnie toksycznych substancji.

Do mikroelementów niewątpliwie należy selen - pierwiastek posiadający tzw. "dwa oblicza". Prawdopodobnie żaden ze znanych składników mineralnych nie był tematem tylu kontrowersyjnych opinii. Od początku lat trzydziestych do połowy lat 50 pierwiastek ten uważany był za toksyczny i rakotwórczy! Późniejsze badania wykazały, że choć w odróżnieniu od innych mikroelementów selen charakteryzuje się niewielką rozpiętością między dawką terapeutyczną a toksyczną, jest on pierwiastkiem niezbędnym i bardzo istotnym do prawidłowego funkcjonowania organizmów żywych.

Podobną historię posiada arsen. Z jednej strony jego związki, znane od starożytności, były narzędziem spiskowców i przyczyną śmiertelnych zatruć wielu dostojników, przywódców państw i organizacji. Rozszerzone badania biochemiczne w zakresie toksykologii arsenu ujawniły drugą stronę tego pierwiastka, pozwalając na stwierdzenie, że np. niektóre jego formy (arseniany(III) -AsO2-) w niewielkich, ściśle kontrolowanych ilościach pobudzają szpik kostny do produkcji czerwonych ciałek krwi zapobiegając anemii. Wciąż wzrastające zainteresowanie rolą, jaką odgrywają selen i arsen w organizmie człowieka wyznacza konieczność opracowania nowych, uniwersalnych i ekonomicznych narzędzi analitycznych - metod oznaczania tych pierwiastków w różnych układach biologicznych (np. płynach ustrojowych, tkankach narządów wewnętrznych, włosach). Jednak oznaczanie selenu i arsenu w materiałach biologicznych nastręcza wiele trudności. Główne przyczyny pojawiających się problemów wynikają z faktu, że pierwiastki te charakteryzują się dużą lotnością oraz niskimi poziomami stężeń (nawet na poziomach toksycznych), a bogata matryca próbek jest dodatkowo przyczyną licznych interferencji zakłócających mierzony sygnał analityczny.

Podstawowym celem niniejszej pracy było przedstawienie problematyki związanej z analizą różnych materiałów biologicznych pod kątem oznaczania selenu i arsenu oraz opracowanie uniwersalnej procedury oznaczania tych pierwiastków w różnych materiałach biologicznych, między innymi w płynach ustrojowych i tkankach. W doborze najwłaściwszej procedury kierowano się zarówno możliwą do uzyskania najlepszą jakością wyników analitycznych (charakteryzujących się przede wszystkim dobrą powtarzalnością i dokładnością), jak również aspektami ekonomicznymi obejmującymi koszt przeprowadzanej analizy, szybkość i prostotę wykonywania poszczególnych oznaczeń itp.

Do analizy materiałów biologicznych pod kątem oznaczania selenu i arsenu, zastosowano postępowanie analityczne obejmujące wykorzystanie wysokociśnieniowej mineralizacji mikrofalowej oraz techniki atomowej spektrometrii fluorescencyjnej połączonej z generacją wodorków (HG-AFS). Technika HG-AFS charakteryzuje się licznymi zaletami (bardzo dużą czułością, szerokim zakresem liniowości wskazań, stosunkowo niską granicą oznaczalności i tanimi wymaganiami aparaturowymi). Wspomniane zalety techniki HG-AFS są bardzo pożądane w dziedzinie badań toksykologicznych i klinicznych.

Pierwsza cześć rozprawy doktorskiej ma charakter opisowy i zawiera przegląd współczesnej literatury naukowej związanej z biochemią i toksykologią selenu i arsenu. Kolejne fragmenty części literaturowej obejmują opis zagadnień związanych z problematyką analizy materiałów biologicznych pod kątem oznaczania pierwiastków śladowych oraz podstawy teoretyczne i zalety zaproponowanej metody atomowej spektrometrii fluorescencyjnej połączonej z generacją wodorków.

Część eksperymentalna pracy doktorskiej zawiera wyniki przeprowadzonych badań związanych z opracowaniem procedury równoczesnego oznaczania obu pierwiastków i zastosowania tej procedury do analizy różnorodnych materiałów biologicznych.

Najpierw wykonano szereg badań polegających na analizie materiałów referencyjnych, co było związane z koniecznością optymalizacji procedury przygotowania różnych materiałów biologicznych i ich analizy pod kątem oznaczania selenu i arsenu oraz eliminacją efektów interferencyjnych obecnych w badanym układzie.

W kolejnych rozdziałach części eksperymentalnej przedstawiono wyniki praktycznego wykorzystania opracowanej procedury. Zamieszczono wyniki licznych badań klinicznych i toksykologiczno-sądowych przeprowadzonych za pomocą nowoopracowanej procedury w ramach współpracy z różnymi ośrodkami naukowymi. Wykonane eksperymenty obejmowały analizę rozmaitych, o różnym stopniu złożoności materiałów biologicznych, a także były ukierunkowane w stronę różnych problemów merytorycznych. Badania dotyczyły m.in. wyznaczania zakresów stężeń fizjologicznych równocześnie obu wspomnianych pierwiastków w próbkach krwi, osoczu, surowicy, moczu i włosach ludzkich, próbkach tkanek mózgu (próbki zwierzęce) oraz poziomów toksycznych w przypadkach ostrych zatruć selenem i arsenem w różnych materiałach sekcyjnych: tkankach narządów wewnętrznych (w tkance płuca, wątroby, nerki itp.), płynach ustrojowych (płynie z gałki ocznej, płynie mózgowo-rdzeniowy, żółci).

Na podstawie analizy tak licznej grupy różnorodnych próbek biologicznych wykazano uniwersalność i użyteczność opracowanej procedury w różnych praktycznych zastosowaniach. Udowodniono, że dzięki bardzo dobrej czułości zaproponowana procedura może być zastosowana do śledzenia minimalnych zmian poziomów stężeń fizjologicznych selenu i arsenu, wywołanych działaniem czynników zewnętrznych (zanieczyszczenia środowiska, diety wzbogaconej interesującymi nas pierwiastkami, sposobem leczenia itp.) na organizm ludzki lub zwierzęcy. Zaletę tę ujawniono w ramach badań obejmujących analizę próbek włosów (w szczególności analizę segmentacyjną), próbek moczu (pobranych od ochotników objętych specjalnie opracowaną dietą o podwyższonej zawartości selenu i arsenu) oraz próbek kory mózgowej szczurów (poddanych eksperymentalnemu modelowi chronicznego stresu i leczeniu antydepresyjnemu). Przeprowadzone badania porównawcze w ramach analizy tkanek nowotworowych tarczycy (o niewielkich masach, znacznie poniżej 0,5 grama) pod kątem oznaczania selenu za pomocą dwóch metod analitycznych (GF-AAS i HG-AFS) wykazały, że tylko metoda o niższej granicy oznaczalności (HG-AFS) umożliwia otrzymanie wiarygodnych wyników analitycznych.

Na koniec przedstawiono zagadnienia związane z zastosowaniem metody dodatków wzorca w celu eliminacji chemicznych efektów interferencyjnych oraz wiarygodności metody odzysku jako sposobu oceny dokładności uzyskanych wyników analitycznych zwłaszcza pod kątem analizy materiałów biologicznych. W ostatnim rozdziale pracy zamieszczono podsumowanie i wnioski z przeprowadzonych badań.

Najistotniejsze konkluzje można podsumować następująco:

  1. Przeprowadzone badania udowodniły, że istnieje możliwość tak osobnego, jak i równoczesnego oznaczania selenu i arsenu w prostych warunkach chemicznych i aparaturowych, oraz że efekty interferencyjne wywoływane przez badane anality nie stanowią istotnego problemu analitycznego.
  2. Zaproponowana procedura rozkładu matrycy biologicznej jest bardzo prosta: obejmuje zastosowanie tylko jednego silnie utleniającego odczynnika (stężonego kwasu azotowego) i stosunkowo krótkiego programu mineralizacji.
  3. Proces eliminacji stwierdzonych w badanych układach efektów interferencyjnych obejmuje innowacyjny, prosty i szybki (dotychczas nie opisany w literaturze) sposób usuwania ich za pomocą gazu obojętnego.
  4. Proces wstępnej redukcji obu pierwiastków jest realizowany poprzez zastosowanie tylko jednego, niedrogiego, wspólnego dla obu pierwiastków odczynnika (6M HCl) dodawanego bezpośrednio przed wykonywaniem pomiarów.
  5. Oznaczenia selenu i arsenu można wykonywać za pomocą krzywych wzorcowych otrzymywanych na drodze kalibracji metodą serii wzorców.
  6. Zaproponowana metoda charakteryzuje się bardzo dobrą dokładnością, co zostało wielokrotnie poddane weryfikacji za pomocą analizy różnorodnych materiałów odniesienia, obejmujących między innymi płyny ustrojowe (krew, surowicę, mocz), tkanki narządów wewnętrznych (wątroby, nerki), mięśnie oraz włosy. Wyznaczone poziomy stężeń oznaczanych pierwiastków charakteryzuje również bardzo dobra powtarzalność.
  7. Przeprowadzone badania optymalizacyjne nad metodą jednoczesnego oznaczania selenu i arsenu udowodniły, że cechuje się ona licznymi, pożądanymi w analizie toksykologiczno-sądowej i klinicznej zaletami, a do najważniejszych z nich należą: bardzo dobra powtarzalność wyników analitycznych, wysoka czułość oraz niska granica oznaczalności.
  8. Niska granica oznaczalności pozwala na zastosowanie proponowanego postępowania analitycznego nie tylko w przypadku oznaczania niskich, fizjologicznych poziomów stężeń (np. w próbkach mózgu), ale również analizę stosunkowo małych próbek (poniżej 0,5 grama) wycinków różnych tkanek narządów wewnętrznych lub tkanek chorobotwórczych (guzów lub zmian nowotworowych).
  9. Wykazano, że w przypadku analizy materiałów biologicznych metoda dodatków wzorca nie zawsze jest zdolna do kompensacji efektów interferencyjnych i może prowadzić do wyznaczenia stężenia analitu z dużymi błędami systematycznymi.
  10. Udowodniono, że z dużą ostrożnością należy również podchodzić do badań i wyników otrzymanych za pomocą bardzo często stosowanej w analizie materiałów biologicznych metody odzysku. Wykazano, że jest ona w takich przypadkach niezwykle zawodna, a jej zastosowanie analityczne bardzo ryzykowne.

Wobec zaprezentowanych w niniejszej rozprawie doktorskiej badań i spostrzeżeń można stwierdzić, że cel badań został osiągnięty, a zaproponowane postępowanie analityczne stanowi nową i w dużej mierze bardzo konkurencyjną metodę oznaczania selenu i arsenu w materiałach biologicznych w porównaniu do już istniejących metod, wykorzystywanych dotychczas w analizie toksykologiczno-sądowej i klinicznej. Dodatkowo znacznie poszerza obszar wykorzystania bardzo cennej techniki, jaką jest technika HG-AFS, dotychczas stosowana głównie do badań geologicznych, hydrologicznych i środowiskowych.