Wróć

Analiza promazyny w materiale biologicznym metodami wysokosprawnej chromatografii cieczowej i elektroforezy kapilarnej w dwóch przypadkach śmiertelnych zatruć

Katarzyna Madej1, Maria Kała2, Michał Woźniakiewicz1

Abstract

Techniki chromatograficzne, a w szczególności wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcją diodową (HPLC-DAD) należą do najczęściej stosowanych metod w analizie materiału biologicznego pod kątem leków. Od początku lat 90-tych ubiegłego wieku ważną pozycję w tej dziedzinie zaczyna zajmować elektroforeza kapilarna (CE) z takimi wariantami separacyjnymi jak: strefowa elektroforeza kapilarna (CZE), micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna (MECC) oraz chiralna elektroforeza kapilarna. Zarówno HPLC jak i CE należą do technik analitycznych o dużym potencjale rozdzielczym, który może być wykorzystany do rozdziału leków w ich mieszaninach, a także do separacji ich od związków występujących w matrycy biologicznej.

Celem niniejszej pracy było wykazanie na przykładach oznaczeń promazyny w materiale biologicznym (krwi i moczu) faktu, iż techniki HPLC i CE posiadając odmienny fizykochemiczny mechanizm separacji, mogą być uważane za komplementarne. Wobec powyższego analizie poddano próby krwi i moczu pobrane w czasie sekcji zwłok od dwóch mężczyzn. Zabezpieczone płyny ustrojowe, stanowiące dowody rzeczowe w dwóch sprawach sądowych, nadesłano do Instytutu Ekspertyz Sądowych w Krakowie celem przeprowadzenia badań toksykologicznych na obecność leków, alkoholu etylowego oraz środków odurzających.

Wspomniany materiał biologiczny w obu przypadkach poddano analizie skryningowej stosując metodę HPLC-DAD zgodnie z systemem identyfikacyjnym leków (MTSS firmy Merck-Hitachi). W wyniku badań skryningowych, w przypadku pierwszego zgonu stwierdzono obecność dużej ilości promazyny, natomiast w drugim przypadku wykazano obok promazyny karbamazepinę. Następnie prowadzono analizę ilościową promazyny w próbach krwi i moczu. Próby te poddano tej samej ekstrakcji, tj. n-heksanem z dodatkiem alkoholu izoamylowego (99:1v/v), a następnie reekstrahowane do fazy wodnej (0,01% kwas fosforowy). Badanie metodą HPLC-DAD wykonano stosując kolumnę z odwróconymi fazami typu RP Select B o wymiarach 125x 4 mm (5ľm) oraz fazę ruchomą stanowiącą mieszaninę acetonitrylu i wody, z przepływem gradientowym. Natomiast analizę metodą MECC przeprowadzono stosując pustą kapilarę krzemionkową o długości 100 cm/66 cm (długość do detektora) i średnicy wewnętrznej 50 ľm oraz bufor separacyjny o składzie 40 mM tetraboranu sodu (pH 9,5) z dodatkiem 10 mM STDC (sól sodowa kwasu taurodeoksycholinowego). Napięcie separacyjne wynosiło 30 kV, a temperatura w kapilarze 25oC. Jako metodę detekcji stosowano spektrofotometrię w zakresie UV przy długości fali ?=254 nm. W celu porównania obu metod (chromatograficznej i elektroforetycznej) oznaczania promazyny we krwi, zestawiono odpowiednie cechy tych metod (powtarzalność parametru identyfikacyjnego, dokładność, granicę detekcji, zakres liniowości), jak również wyniki rozdziału w postaci chromatogramów i elektroferogramów oraz ostateczne wyniki oznaczeń promazyny w badanych próbach biologicznych. Uzyskane wyniki wskazują, że elektroforeza kapilarna może być stosowana w analizie sądowej jako technika komplementarna lub alternatywna dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej